Izvorni kod stranice Cirkularni dihroizam

'''Cirkularni dihroizam (CD)''' zasniva se na različitoj apsorpciji desno i levo kružno polarizovane [[svetlost]]i koja je posledica strukturne asimetrije.<ref name="Fasman">{{Cite book |author=Fasman, G.D. |title=Circular dichroism and Conformational Analysis of Biomolecules |year=1996 |publisher=Plenum press |location=New York}}</ref> Uređene strukture imaju CD signale dok neuređene nemaju. CD [[spektroskop]]ija je metoda koja se koristi za utvrđivanje [[Stereoizomerija|optičke izomerije]] [[molekul]]a, a i za određivanje [[Sekundarna struktura proteina|sekundarne]] i [[Tercijarna struktura proteina|tercijarne strukture]] [[protein]]a<ref name="Практикум1_2007">{{Cite book |author=A. Popović-Bijelić, M. Mojović |title=Praktikum iz biofizičke hemije |publisher=Univerzitet u Beogradu- Fakultet za fizičku hemiju |issue=1. |year=2007 |location=Beograd}}</ref>.

== Poreklo elipticiteta ==
[[Datoteka:Circular dichroism.png|mini|desno|200p|Prikaz različite apsorpcije desno i levo kružno polarizovane svetlosti]]

Zbog asimetrične raspodele naelektrisanja kod optički aktivnih molekula, desno i levo kružno polarizovani talasi će se kretati različitim brzinama (zbog različitih [[indeks prelamanja|indeksa prelamanja]], n<sub>D</sub> ≠ n<sub>L</sub>). Kao posledica toga, [[fazni pomeraj]] između levo i desno kružno polarizovanog talasa posle prolaska kroz [[optički aktivna sredina|optički aktivnu sredinu]] će biti različit od onog pre prolaska kroz optički aktivnu sredinu, pa će [[ravan polarizacije]] [[linearno polarizovana svetlost|linearno polarizovane svetlosti]] posle prolaska kroz optički aktivnu sredinu biti zakrenuta za određeni ugao u odnosu na ravan polarizacije linearno polarizovanog upadnog snopa.<ref name="Hecht">{{Cite book |author=Hecht, E. |title=Optics |url=https://archive.org/details/optics0000hech_e5d5 |edition=3rd |year=1998 |publication=Addison Wesley Longman |location=Massachusetts}}</ref> Ako su za datu optički aktivnu supstancu različiti i [[molarni apsorpcioni koeficijent]]i za desno i levo kružno polarizovanu svetlost (ε<sub>D</sub> ≠ ε<sub>L</sub>) izlazni snop će biti eliptično polarizovan<ref name="Практикум1_2007" />.

Za datu talasnu dužinu, razlika između apsorbancije levo kružno polarizovane i desno kružno polarizovane svetlosti (ova veličina se obično meri):

:<math>\Delta A=A_L-A_D \,</math> 
                 
Primenom [[Berov zakon|Berovog zakona]] dobijamo sledeću zavisnost:

:<math>\Delta A = (\epsilon_L - \epsilon_D)Cl\,</math>
                 
gde su:
:ε<sub>L</sub> i ε<sub>D</sub> molarni apsorpcioni koeficijenti za levo kružno polarizovanu i desno kružno polarizovanu svetlost,
:''C'' molarna koncentracija
:''l'' dužina puta u centimetrima (cm).
 
Tada je:

:<math> \Delta \epsilon =\epsilon_L-\epsilon_D\,</math>

molarni cirkularni dihroizam. Na ovu veličinu se najčešće misli pod pojmom cirkularni dihroizam supstance. Iako se često meri ΔA, uobičajeno je da se ekscentricitet eliptično polarizovane svetlosti izrazi veličinom koja se zove [[elipticitet]] (θ), θ = [[arctan]] (a/b). Da bi bilo moguće poređenje elipticiteta za uzorke različitih koncentracija potrebno je izraziti elipticitet po jedinici koncentracije, ili po broju rezidua. Zato se uvodi nova veličina - molarni elipticitet [θ].<ref>{{cite web |url=http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss-960531_21.html |title=Circular dichroism spectroscopy }}{{Dead link|date=August 2024 |bot=InternetArchiveBot |fix-attempted=yes }}</ref>

[[Datoteka:Electric Vectors 1.png|200p|mini|desno|Eliptično polarizovana svetlost (ljubičasta) je sastavljena od različitih doprinosa desno (plava) i levo (crvena) cirkularno polarizovane svetlosti]]

Molarni cirkularni dihroizam i [[molarni elipticitet]], [θ], povezani su sledećom jednačinom:

:<math> [\theta] = 3,298.2\Delta \epsilon\, </math>

Ova veza je izvedena iz definisanja elipticiteta polarizacije kao:

:<math> tan \theta = \frac{E_D - E_L}{E_D + E_L} \,</math>
 
gde su ''E<sub>D</sub>'' and ''E<sub>L</sub>'' veličine vektora električnog polja desno-kružno i levo-kružno polarizovane svetlosti.

Kada je ''E<sub>D</sub>'' jednako ''E<sub>L</sub>'' (kada nema razlike u apsorpciji desno i levo-kružno polarizovane svetlosti), θ = 0° i svetlost je linearno polarizovana. Kada je ili ''E<sub>D</sub>'' ili ''E<sub>L</sub>'' jednako nuli, θ je 45° i svetlost je kružno polarizovana.

Kako je efekat cirkularnog dihroizma mali, odnosno ''tan'' θ ima malu vrednost i može se aproksimirati sa θ u radijanima. Intenzitet svetlosti, I, proporcionalan je kvadratu vektora električnog polja, tako da elipticitet postaje:
                           
:<math> \theta (radians) = \frac{(I_D^{1/2} - I_L^{1/2})}{(I_D^{1/2} + I_L^{1/2})}\,</math>

Zatim možemo izraziti intenzitete u prethodnoj jednačini korišćenjem Berovog zakona u obliku prirodnog logaritma:

:<math> I = I_0 e^{-A\ln{10}}\,</math>

Elipticitet sada može biti napisan kao:

:<math> \theta (rad) = \frac{(e^{\frac{-A_D}{2}ln10} - e^{\frac{-A_L}{2}ln10})}{(e^{\frac{-A_D}{2}ln10} + e^{\frac{-A_L}{2}ln10})} = \frac{e^{\Delta A \frac{ln10}{2}} - 1}{e^{\Delta A \frac{ln10}{2}} + 1} \,</math>

Kada je ΔA<<1, ovaj izraz može biti aproksimiran razvijanjem eksponencijalnih članova u [[Tejlorov red]] do prvog stepena (možemo zanemariti članove viših stepena) i zatim zanemarivanjem ΔA u poređenju sa jedinicom, kao i pretvaranjem radijana u stepene dobijamo sledeći izraz:

:<math> \theta (deg) = \Delta A \left(\frac {ln10}{4} \right) \left(\frac {180}{\pi} \right)\, </math>

Linearna zavisnost koncentracije rastvora i dužine puta je uklonjena definisanjem molarnog elipticiteta kao:

:<math> [\theta] = \frac {100\theta}{Cl}\, </math>

Onda kombinovanjem poslednja dva izraza sa Berovim zakonom, molarni elipticitet postaje:

:<math> [\theta]= 100 \Delta \epsilon \left(\frac {ln10}{4} \right) \left(\frac {180}{\pi} \right) = 3,298.2\Delta \epsilon \,</math>

Molarni elipticitet zavisi od prirode supstance i talasne dužine upadnog zračenja.

Grafički predstavljena zavisnost molarnog elipticiteta neke supstancije od talasne dužine upadnog zračenja, [θ] = f(λ), zove se ''spektar cirkularnog dihroizma'' ili CD spektar date supstancije<ref name="Практикум1_2007" />.

== Primena na biološke molekule ==

Skoro svi biološki molekuli su optički aktivni. Kako se CD primenjuje na apsorpcione trake bilo kog optički aktivnog molekula, on će biti primenjen za biološke molekule, zbog desne rotacije (npr. neki [[šećer]]i) i leve rotacije (npr. neke [[aminokiseline]]) koju oni poseduju. Takođe možemo odrediti [[sekundarna struktura proteina|sekundarnu strukturu]] posmatranjem CD za dati molekul. Dakle, [[alfa heliks]] [[protein]]a i dupli (dvolančani) heliks nukleinskih kiselina imaju karakteristične CD spektre za svoje strukture.

CD je usko povezan sa tehnikom optičke rotacione disperzije (ORD), s tim što se CD smatra naprednijom tehnikom. CD se meri blizu apsorpcionih traka od interesa, dok se ORD može meriti daleko od ovih traka. Međutim, zbog disperzione prirode ORD, CD je osetljivija analitička metoda. U principu, ova dva merenja mogu biti povezana tzv. [[Konig-Kramerova transformacija|Konig-Kramerovim]] transformacijama, ako su sve apsorpcije obuhvaćene merenjem.

Ultraljubičasti CD spektar proteina može predvideti važne karakteristike njihove [[sekundarna struktura proteina|sekundarne strukture]]. Predikcija sekundarne strukture zasniva se na pretpostavci da je CD spektar proteina, zbog izrazite optičke aktivnosti peptidne [[hromofor]]e, odraz njegove sekundarne strukture. Za peptidnu hromoforu karakteristični su n -> π* prelaz na 220&nbsp;nm i π -> π* prelaz na 190&nbsp;nm. Procenu strukture proteina se vrši pomoću CD spektara sintetičkih polimera koji imaju strukturu 100 % [[Alfa heliks|α-heliksa]], 100% [[Beta ravan|β-ravni]], 100% nasumičnog klupka (slučajna struktura) itd. Ova frakcionalna imenovanja važna su jer upućuju na moguće sekundarne konformacije u kojima može biti protein. Na primer, poli-L-lizin {(Lys)n} može usvojiti 3 različite konformacije samo za različite vrednosti [[pH vrednost|pH]] i temperature: nasumično klupko na pH 7,0 ; [[Alfa heliks|α-heliks]] na pH 10,8 ; [[Beta ravan|β-oblik]] na pH 11,1 posle zagrevanja do 52&nbsp;°C i hlađenja.

CD spektar nepoznatog proteina = f<sub>α</sub>S<sub>α</sub>(λ) + f<sub>β</sub>S<sub>β</sub>(λ) + f<sub>RC</sub>S<sub>RC</sub>(λ), gde su S<sub>α</sub>(λ), S<sub>β</sub>(λ), i S<sub>RC</sub>(λ) izvedene iz osnovnog spektra poli-L-lizina. Nedostatak ove metode je to što iako je lako dobiti vrednosti za S<sub>α</sub>(λ), S<sub>β</sub>(λ), i S<sub>RC</sub>(λ) iz direktnih merenja, one nisu uvek usaglašene od jedne laboratorije do druge. Takođe, mora se uzeti u obzir i dužina lanca i uticaj [[agregatno stanje|agregatnog stanja]] ovog skupa baza spektra. Međutim, ovaj metod je obično tačan do 10% za sadržaj [[Alfa heliks|α-heliksa]].

Na osnovu CD-a ne može se tačno reći na kom mestu u molekulu se dati α-heliksi nalaze, pa čak ni predvideti koliko ih ima. Uprkos ovome, CD je dragocen alat, naročito za pokazivanje konformacijskih promena. Na primer, može se koristiti za određivanje zavisnosti sekundarne strukture molekula od temperature ili koncentracije denaturisanih agenasa. Na taj način on može dati važnu termodinamičku informaciju o molekulu koja ne može inače biti lako dobivena. Bilo koji pokušaj ispitivanja proteina će dovesti do zaključka da je CD značajan za proveravanje da li je dati protein u svojoj nativnoj (savijenoj) konformaciji pre njegovog podvrgavanja skupim i/ili dugim eksperimentima.

Za određivanje [[sekundarna struktura proteina|sekundarne strukture]], posmatraju se spektri u dalekoj [[UV]] oblasti (190-250&nbsp;nm) i ukoliko je protein u nativnoj (savijenoj) konformaciji – peptidna veza će davati CD signal.

Za određivanje [[Tercijarna struktura proteina|tercijarne strukture]], posmatraju se CD spektri u bliskoj [[UV]] oblasti (250-350&nbsp;nm) i ukoliko je protein u nativnoj konformaciji, CD signali će poticati od aromatičnih aminokiselina i [[disulfidni most|disulfidnih mostova]]. Signali u oblasti od 250-270&nbsp;nm potiču od fenilalanina, od 270-290&nbsp;nm od tirozina i od 280-300&nbsp;nm od [[triptofan]]a. [[Disulfidna veza|Disulfidne veze]] daju široke, slabe signale u celoj bliskoj [[UV]] oblasti. Ukoliko ne postoji nikakav signal u oblasti od 250-350&nbsp;nm, znači da se protein ne nalazi u nativnoj konformaciji.<ref name="Практикум1_2007" />.

CD daje manje specifičnu informaciju o strukturi od npr. rendgeno-strukturne analize ili [[NMR]] spektroskopije proteina, koje daju podatke o atomima. Međutim, CD spektroskopija je brza metoda, koja ne zahteva velike količine proteina, niti dugu obradu podataka. CD se može koristiti za ispitivanje uslova rastvorljivosti, promene temperature, [[pH vrednost|pH]], [[jonska jačina|jonske jačine]] i prisustva različitih faktora.

CD spektroskopija se obično koristi za proučavanje proteina u rastvorima, i kao dopunska metoda za proučavanje čvrstog stanja. Ovde takođe postoji ograničenje, jer se mnogi proteini ubačeni u membrane nalaze u svom nativnom stanju, pa su rastvori membrana nehomogeni zbog čega rasejavaju svetlost. CD se ponekad meri u tankim filmovima.

== Eksperimentalna ograničenja ==

CD može da se koristi i za proučavanje [[Ugljeni hidrati|ugljenih hidrata]], ali sa ograničenim uspehom zbog teškoća povezanih sa snimanjem CD spektra u vakuum ultraljubičastoj ([[UV|VUV]]) oblasti spektra (100-200&nbsp;nm), gde odgovarajuće CD trake nesupstituisanih [[Ugljeni hidrati|ugljenih hidrata]] leže. Spektri supstituisanih ugljenih hidrata sa trakama iznad [[UV|VUV]] oblasti se uspešno snimaju .

Merenja CD-a takođe su komplikovana zbog činjenice da vodeni jonski [[pufer]]ski sistemi često apsorbuju u oblasti gde strukturne osobine pokazuju različitu apsorpciju kružno polarizovane svetlosti. Pri snimanju CD spektara [[fosfat]]nih, [[sulfat]]nih, [[karbonat]]nih i [[acetat]]nih [[jon]]a moraju se koristiti veoma razblaženi rastvori. [[Borati]] i [[amonijum soli]] se često koriste za određivanje odgovarajuće pH oblasti za CD probe. Za povećanje jonske jačine, neki eksperimentatori zamenjuju hloridni jon fluoridnim, jer fluoridni jon apsorbuje manje u dalekoj [[UV]] oblasti, a neki rade u čistoj vodi. Drugi način da se minimizira apsorpcija rastvarača je primena užih ćelija, čime se smanjuje put svetlosti kroz ispitivani uzorak (obično kada se radi u dalekoj [[UV]] oblasti koriste se ćelije širina do 0,1&nbsp;mm ).

CD spektri proteina korišćeni za procenu [[Sekundarna struktura proteina|sekundarne strukture]] povezani su sa π - π* prelazima, koji su posledica apsorpcije [[amidna veza|amidne veze]]. Ove apsorpcione trake leže delimično u vakuumskoj ultraljubičastoj oblasti (talasne dužine manje od 200&nbsp;nm). Oblast ove talasne dužine je nepristupačna zbog snažne apsorpcije [[kiseonik]]a, tako da je snimanje na instrumentima oslobođenim od [[kiseonik]]a (punjenim čistim gasom [[azot]]om) neophodno.

Kada je uklonjen [[kiseonik]], drugi najvažniji tehnički faktor u radu ispod 200&nbsp;nm je da ostatak optičkog sistema ima manje gubitke u ovoj oblasti. Zato treba koristiti [[aluminijum|aluminizirana]] ogledala čiji premazi su optimizirani za nizak gubitak u ovoj oblasti spektra.

Takođe je potrebno da se dostigne adekvatan odnos [[signal-šum odnos|signal-šum]] (S/N je proporcionalno kvadratnom korenu dela vremena za koje se snima spektar). Zato je potrebno 30-60 min. da se snime spektri za određivanje [[Sekundarna struktura proteina|sekundarne strukture]] (plus isti deo vremena za baznu liniju za svaki CD spektrometar).

Uobičajen izvor svetlosti u ovim instrumentima je kratko-lučna [[ksenonska lampa]] pod visokim pritiskom. Obične ksenonske lučne lampe su neprikladne za upotrebu u dalekoj [[UV]] oblasti. Umesto specijalno sagrađenih lampi sa omotima napravljenim od sintetike visoke čistoće, rastopljeni [[silikati]] moraju biti upotrebljeni. Svetlost sa izvora sinhrotrona ima mnogo veći fluks na kraćim talasnim dužinama i korišćena je za CD ispod 160&nbsp;nm.

Na nivou [[kvantna mehanika|kvantne mehanike]], sadržaj informacija CD-a i [[optička rotacija|optičke rotacije]] je identičan.

== Izvori ==
{{reflist|2}}

== Literatura ==
* {{Cite book |ref= harv|author=Fasman, G.D. |title=Circular dichroism and Conformational Analysis of Biomolecules |year=1996 |publisher=Plenum press |location=New York}}
* {{Cite book |ref= harv|author=A. Popović-Bijelić, M. Mojović |title=Praktikum iz biofizičke hemije |publisher=Univerzitet u Beogradu- Fakultet za fizičku hemiju |issue=1. |year=2007 |location=Beograd}}
* {{Cite book |ref= harv|author=Hecht, E. |title=Optics |url= https://archive.org/details/optics0000hech_e5d5|edition=3rd |year=1998 |publication=Addison Wesley Longman |location=Massachusetts}}

== Vanjske veze ==
* [http://www.ap-lab.com/circular_dichroism.htm Circular Dichroism explained] - A commercial supplier's site, but very good information with examples, etc.
* [http://www2.umdnj.edu/cdrwjweb/index.htm#software Circular Dichroism at UMDNJ] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20090429064346/http://www2.umdnj.edu/cdrwjweb/index.htm#software |date=2009-04-29 }} - a good site for information on structure estimation software
* [http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo1.htm Electromagnetic waves] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20070422235859/http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo1.htm |date=2007-04-22 }} - Animated electromagnetic waves

{{-}}
{{Sekundarna struktura proteina}}
{{Metode za određivanje strukture proteina}}
{{Spektroskopija}}

[[Kategorija:Polarizacija]]
[[Kategorija:Struktura proteina]]
[[Kategorija:Biofizička hemija]]