Izvorni kod stranice Fluorescentno rezonantni energetski transfer

[[Datoteka:ADP ribosylation factor localization in the Golgi apparatus of a living macrophage.png|thumb|right|200px|Fluorescentno obeležena [[guanozin]] 5'-[[guanozin trifosfat|trifosfat]] [[hidrolaza]] (ARF) ukazuje na proteinsku lokalizaciju [[Goldžijev aparat|Golgdžijevog aparata]] živog [[makrofag]]a.<ref>''Inconspicuous Consumption: Uncovering the Molecular Pathways behind Phagocytosis.'' Inman M, PLoS Biology Vol. 4/6/'''2006''', e190. {{DOI|10.1371/journal.pbio.0040190}}</ref>]]

'''Fluorescentno rezonantni energetski transfer''' (FRET) je prenos [[kvant]]a [[energija|energije]] sa mesta [[apsorpcija|apsorpcije]] na mesto iskorišćenja u [[molekul]]u, ili u sistemu molekula, bez emitovanja [[zračenja]], kroz rezonantnu [[interakcija|interakciju]] između [[hromofora]] preko rastojanja koje je znatno veće od interatomskog, bez konverzije u [[toplotna energija|toplotnu energiju]] i bez [[donor]]sko [[akceptor]]skih kinetičkih sudara. Donor je obojeni [[molekul]] koji početno apsorbuje energiju, dok je akceptor hromofora na koju se zatim prenosi energija. FRET se drugačije naziva i Forsterov energetski [[transfer]], jer ga je nemački naučnik [[Teodor Forster]] (Theodor Förster) prvi uočio i matematički formulisao.

S obzirom da rastojanje između donora i akceptora mora da bude između 1 i 10&nbsp;nm (odnosno između 10 i 100 Ǻ) da bi došlo do prenosa energije i da je efikasnost prenosa zavisna od rastojanja između [[fluorofora]], rezonantni energetski transfer može biti pouzdano sredstvo za ispitivanje molekulskih [[interakcija]].

Mehanizam fluorescentno rezonantnog transfera energije uključuje donorsku fluoroforu u pobuđenom stanju, koja može preneti svoju ekscitovanu energiju ka susednoj akceptorskoj hromofori, bez emitovanja zračenja, kroz [[dipol]]-dipol interakcije dugog dometa. Teorijsko razmatranje energetskog prenosa je bazirano na konceptu koji tretira pobuđenu fluoroforu kao [[oscilator]]ni dipol koji može podneti razmenu energije sa drugim dipolom koji ima sličnu rezonantnu [[frekvencija|frekvenciju]]. U tom kontekstu, rezonantni prenos energije je analogan ponašanju kuplovanih [[oscilacija]], kao na primer par zvučnih viljuški koje [[vibracija|vibriraju]] istom frekvencijom. Sa druge strane, prenos energije uz emitovanje zračenja zahteva emisiju i reapsorpciju [[foton]]a i zavisi od fizičkih dimenzija i [[optika|optičkih]] svojstava uzorka, kao i od pravca rasprostiranja [[elektromagnetni talas|elektromagnetnih talasa]]. Za razliku od prenosa energije uz emitovanje zračenja, proučavanjem rezonantnog prenosa energije mogu se dobiti informacije o [[struktura|strukturi]] za dati par donora i akceptora.

Efikasnost prenosa energije obrnuto je srazmerna šestom stepenu rastojanja između molekula donora i akceptora. Usled toga, FRET merenja mogu biti iskorišćena kao efektivna metoda za određivanje rastojanja između molekula označenih kao odgovarajući donor i akceptor, kada se oni nalaze na rastojanju od najmanje 1&nbsp;nm.

== Donori i akceptori energije ==
[[Datoteka:E 426.003 in Tábor.jpg|desno|thumb|250px|Slika 1. Dijagram Jablonskog ilustruje sve kuplovane prelaze koji postoje između emisije donora i apsorpcije akceptora prilikom fluorescentno rezonantnog energetskog transfera.]]

Donor energije je po pravilu fluorescentni molekul. Kada [[svetlost]] određene [[talasna dužina|talasne dužine]] (250 – 500&nbsp;nm) pobudi molekule donora, njegovi [[elektron]]i prelaze sa osnovnog (''S''<sub>O</sub>) na više vibracione nivoe (''S''<sub>1</sub>, ''S''<sub>2</sub>, ''S''<sub>3</sub>, itd). U vrlo kratkom vremenu, reda veličine pikosekunde, ovi elektroni se zatim relaksiraju, tj. prelaze na najniži od pomenutih vibracionih nivoa (''S''<sub>1</sub>), a zatim znatno sporije (reda veličine nanosekunde) se vraćaju na jedan od ''S''<sub>O</sub> nivoa, emitujući foton čija je [[talas]]na dužina veća od talasne dužine svetlosti koja je ekscitovala molekule donora (Slika 1.)

Kada su molekuli donora u ekscitovanom stanju, dolazi do rezonantnog prenosa energije ka hromofori, tj. akceptoru, koji se nalazi u neposrednoj blizini. Rezultujući emisioni [[spektar]] akceptora nakon takvog energetskog prenosa ima veoma slične karakteristike kao njegov početni [[emisioni spektar]].

U većini slučajeva, donor i akceptor su različito obojeni molekuli, i tada se FRET može detektovati po pojačavanju emisije akceptora, ili pak po slabljenju emisije donora.

Da bi uopšte došlo do rezonantnog transfera energije neophodno je ispuniti nekoliko osnovnih uslova:
• Molekuli donora i akceptora moraju biti u neposrednoj blizini (približno od 1 do 10&nbsp;nm);
• [[Apsorpcioni spektar]] akceptora se mora preklopiti sa emisionim spektrom donora (Slika 2.);
• [[Tranzicioni dipol]]i donora i akceptora moraju biti približno paralelno orijentisani;
• Donor energije mora imati veliku vrednost za kvantni doprinos.

Ukoliko je veći stepen preklapanja odgovarajućih spektara i što je bolja paralelna orijentacija tranzicionih dipola donora i akceptora, to će fluorescentni transfer energije biti favorizovan u odnosu na relaksaciju fluorescencije donora.

== Matematička formulafija FRET-a ==
Ekscitovana energija elektrona može efikasno biti preneta između fluorescentnog donora energije i pogodnog energetskog akceptora preko distance veće od 10 [[Å]]. Godine [[1948]]. [[Nemačka|nemački]] naučnik Teodor Forster predstavio je [[teorija|teoriju]] dipol-dipol energetskih transfera po kojoj je [[konstanta brzine|konstanta brzina]] prenosa energije, ''k''t, obrnuto proporcionalna šestom stepenu rastojanja između donora i akceptora:
: <math> k_t = 8.71 \times 10^{23} \; \ r^{-6} \, \kappa^2 \, n^{-4} \, k_F \, J </math>,

[[geometrija|Geometrijske]] promenljive veličine u gornjem izrazu su:
''r'' – rastojanje između centara donorske i akceptroske hromofore;
:<math>\kappa^2</math> – [[orijentacioni faktor]] za dipol-dipol interakcije.

[[spektroskopija|Spektroskopske]] promenljive su:

''J'' - integral preklapanja spektara (definisanim u daljem tekstu);

''n'' - [[indeks refrakcije]] medijuma;

''k''<sub>F</sub> - konstanta brzine fluorescentne emisije zračenja donora;

Zavisnost između efikasnosti prenosa energije, E, i rastojanja između donora i akceptora, R, je data jednačinom:
: <math>E=\frac{1}{(1+(r/R_0)^6)}\!</math>

gde je ''R''<sub>O</sub> Forsterovo rastojanje, koje predstavlja ono rastojanje između donora i akceptora za koje je efikasnost energetskog prenosa 50% (tj. 50% ekscitovanih donora je deaktivirano energetskim prenosom).

Ro (Å) se može izračunati pomoću:
: <math> {R_0}^6 = 8.8 \times 10^{23} \; \kappa^2 \, n^{-4} \, Q_d \, J </math>
gde je ''Q''<sub>d</sub> [[kvant]]ni doprinos fluorescencije donora energije u odsustvu akceptora i predstavlja spektroskopsku promenljivu (ostale veličine su prethodno definisane), dok se [[integral]] preklapanja može izračunati prema sledećoj formuli:
: <math> J = \int f_{\rm D}(\lambda) \, \epsilon_{\rm A}(\lambda) \, \lambda^4 \, d\lambda </math>
gde je ''λ'' talasna dužina svetlosti, ''ε''<sub>A</sub>(λ) [[molarna apsorptivnost akceptora]] na datoj talasnoj dužini, a ''f''<sub>D</sub>(λ) emisioni spektar donora normalizovan po talasnoj dužini:
: <math> f_D =  \frac {f_{\rm D lambda}{(\lambda)}} {\int f_{\rm D lambda}{(\lambda) \, d\lambda}} </math>
''f''<sub>Dlambda</sub> (λ) je emisija donora po jedinici intervala talasne dužine.

== Efikasnost energetskog prenosa, E ==
Efikasnost energetskog prenosa može biti određena na tri različita načina:

* Iz vremena života [[Ekscitovano stanje|eksitovanog stanja]] donora u odsustvu (<math>\tau'_{\rm D}</math>) i prisustvu (<math>\tau_{\rm D}</math>) akceptora.
: <math> E = 1 - {\tau'_{\rm D}}/{\tau_{\rm D}} \!</math>

* Iz kvantnog doprinosa donora u odsustvu (<math>F'_{\rm D}</math>) i prisustvu akceptora (<math>F_{\rm D}</math>).
:<math> E = 1 - {F'_{\rm D}}/{F_{\rm D}} \!</math>

* Iz emisionih spektara donora, akceptora i dvosloja (odnosno relativnog emisionog intenziteta).

Efikasnost energetskog prenosa određena metodama 1 i 2 je definisana pod pretpostavkom da nanošenje sloja akceptora na sloj donora ne menja kvantnu efikasnost donora. Drugim rečima, lokalno okruženje donora mora biti identično i u odsustvu i u prisustvu akceptora.

== BRET ==
Ograničenje FRET-a je zahtev za spoljašnjom iluminacijom da bi se inicirao fluorescentni transfer, što može da dovede do pozadinskog šuma u merenjima usled direktne ekscitacije akceptora ili fotoizbeljavanja. Da bi se izbegao ovaj nedostatak, [[Bioluminiscencija|bioluminescentno]] rezonantni energetski transfer (ili ''BRET'') je razvijen. Ta tehnika koristi bioluminescentnu [[luciferaza|luciferazu]] (tipično luciferazu iz ''[[Renilla reniformis]]'') umesto CFP-a za proizvođenje inicijalne fotonske emisije.

FRET i BRET su isto tako uobičajeni metodi u studiranju [[Enzimska kinetika|biohemijske reakcione kinetike]] i [[molekulski motor|molekularnih motora]].

== Reference ==
{{reflist}}

== Literatura ==
* {{cite journal |author = Alexander Hillischa, Mike Lorenzb, Stephan Diekmann |doi=10.1016/S0959-440X(00)00190-1 |title = Recent advances in FRET: distance determination in protein–DNA complexes |journal = Current Opinion in Structural Biology |year = 2001 |volume = 11 |issue = 2 |pages = 201–207 |url = http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001901}}

== Vanjske veze ==
* [http://www.biotek.de/products/tech_res_detail.php?id=159 Biotek] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20070928174631/http://www.biotek.de/products/tech_res_detail.php?id=159 |date=2007-09-28 }}
* [http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fret/fretintro.html Olympus Microscopy Resource Center] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20110716060817/http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fret/fretintro.html |date=2011-07-16 }}

[[Kategorija:Fizikalna kemija]]
[[Kategorija:Biofizika]]